Бактериологический метод диагностики кори
Для постановки диагноза корь зачастую необходимо лабораторное
подтверждение инфекции. Самое лучшее время для сдачи анализов — первый контакт
пациента с врачом. Врача необходимо вызывать на дом, так как корь — это заразное
заболевание и поход в поликлинику может стать причиной заражения многих восприимчивых
детей и взрослых. Забор материала для исследования может выполнить врач или
медсестра, которую доктор может прислать чуть позже.
1 больной корью может заразить 12—18 восприимчивых человек [1]. Подробнее в статье «Как можно заразиться корью?».
Стандартом лабораторной диагностики кори в большинстве стран
являются серологическое исследование и ПЦР-диагностика.
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Суть метода заключается в идентификации РНК вируса кори в крови,
слизи носоглотки/ротоглотки, бронхиальном секрете или моче.
ПЦР-исследование рекомендуется проводить как можно раньше после
появления сыпи, так как количество вируса в организме снижается с течением
времени. Наиболее информативным является период первых 1—3—7 дней от начала
высыпаний [2—5]. В литературе имеются сведения о том, что у некоторых пациентов
вирус кори может определяться в носоглоточном секрете до 10—14 дня болезни [5].
Для наиболее точной диагностики рекомендуется производить забор
материала из трех разных локусов (кровь, мазок из носоглотки или ротоглотки и
моча). Это повышает вероятность правильного диагноза [4,5].
После забора материала для ПЦР (мазок и моча) допустимо его хранение
до 1 суток в холодильнике (4 °С), возможно замораживание. Если для исследования
используется моча, то ее объем должен быть не менее 10 мл, но лучше 50 мл. Утренняя
первая моча содержит максимальное количество вируса [4].
Отрицательный результат ПЦР не исключает диагноза кори [6].
Ложноотрицательный результат может быть получен при позднем заборе
материала (более 3—7 дней с момента появления сыпи), предшествующей недавней
вакцинации против кори, при нарушениях хранения и/или транспортировки образцов
[4,5].
В соответствии с международными рекомендациями при выполнении ПЦР
желательно определять генотип вируса кори. Это необходимо для четкого
различения происхождения вируса (дикий штамм или вакцинный), учета
распространения вируса по земному шару и происхождения очагов/вспышек
заболевания [4].
На сегодняшний день известно 24 генотипа вируса кори. Большинство
из них вышло из циркуляции, однако менее 10 из них (по данным ВОЗ — 6 [7]) все еще присутствуют на нашей планете [8].
2. Серологический метод.
Метод заключается в определении специфических антител (IgM и IgG) против вируса кори в сыворотке крови.
Для верификации диагноза кори достаточно определить один класс
антител IgM или IgG. Каковы особенности анализа?
— IgM.
IgM определяется в крови в течение 1 месяца (28 дней [3]) у больного
корью после появления высыпаний. Пик IgM отмечается
на 7—10 сутки от момента появления сыпи, а затем количество антител постепенно
снижается. Через 6—8 недель от начала сыпи IgM уже может не
определяться [9].
Если больной ранее прививался против кори (1 или 2 прививки) то
при реинфекции вирусом кори IgM у него может не определяться
вовсе или быть повышенным только короткий промежуток времени, который трудно
зафиксировать [6].
Отрицательный анализ на IgM не исключает наличие заболевания у ранее привитых.
В некоторых случаях у ранее не привитых пациентов IgM может быть ложноотрицательными
(около 20—25% проб). Это характерно для образцов, взятых в первые 72 часа от
начала появления сыпи. Дело в том, что концентрация антител в первые дни
болезни еще мала и недостаточна для определения [10,11].
Если результат был отрицательным и сыпь присутствует более 72
часов должен быть выполнен повторный анализ (допустимо выполнить анализ до 10
дня болезни) [6].
Кроме того, ложноотрицательный результат может быть получен, если анализ выполнен позже 28 дней с момента появления сыпи.
Ложноположительный результат возможен при проведенной ранней
вакцинации против кори (в течение предшествующих 6 недель до появления сыпи), наличии
повышенного ревматоидного фактора, при сопутствующих острых воспалительных
заболеваний [5].
В каждом отдельном случае проводится изучение течения заболевания,
особенностей пациента и/или дополнительная диагностика.
Наряду с определением IgM / IgG для диагностики кори, также настоятельно рекомендуется выполнять ПЦР [12].
Положительный анализ на IgM только при
наличии характерной клинической картины и данных о контакте с больным
корью свидетельствует об остром течении коревой инфекции. Положительный
анализ на IgM при отсутствии характерной клинической картины или контакта с
больным корью не является основанием для постановки диагноза. В таких случаях
рекомендуется выполнить ПЦР исследование [3].
— IgG.
Определение IgG является информативным анализом
для подтверждения кори в случае отсутствия возможности провести ПЦР
исследование и/или когда IgM является отрицательным или
сомнительным [6].
Исследование проводится в парных сыворотках: первый анализ должен
быть выполнен в первые 4—7 дней от начала высыпаний, второй — в течение 10—30
дней после первого [2,3].
IgG достигают пика через 4 недели от начала сыпи [9].
Положительным результат считается, если:
— произошла сероконверсия (в первом анализе IgG
отрицательны, во втором — положительны);
— отмечается значительное (в 4 и более раз) повышение уровня IgG.
Сероконверсия не является информативной при недавно проведенной
вакцинации (в течение предшествующих 6 недель).
Ранее вакцинированные, получившие две прививки и не выработавшие
защитных антител (такое встречается, но очень редко), при заболевании корью
могут не иметь повышение IgG в 4 раза при втором анализе IgG по сравнению
с первым [3]. Отрицательное значение IgG в двух
анализах исключает наличие коревой инфекции.
ИФА — метод, одобренный ВОЗ для определения IgG и IgM для диагностики коревой инфекции [10].
3. Вирусологический метод.
Для идентификации вируса кори иногда может применяться вирусологический метод. Суть его заключается в том, что вирус, полученный от больного, культивируется в клеточной культуре. Этот метод является особо точным, но занимает около двух недель. Вирусологический метод не рекомендуется для рутинного обследования при подозрении на корь [2,5,6,8].
Источник
Бактериологическое исследование – способ проверки биоматериала на наличие
возбудителя инфекционного заболевания. Метод бакпосева позволяет выявить и идентифицировать патогенный микроорганизм даже при относительно малых его концентрациях в тканях. Для этого исследуемые образцы высевают на питательные среды и культивируют для получения визуально видимых колоний возбудителя. Полученные штаммы бактерий типируют и проверяют на устойчивость к антибиотикам.
На заметку! Бактериологические методы исследования уступают по точности иммуноферментному анализу (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР), но в отличие от них, с высокой точностью определяют степень чувствительности выделенных штаммов бактерий к группам антибиотиков. Полученный результат позволяет подобрать максимально эффективное лечение и скорректировать дозы лекарств.
Процедура занимает несколько суток (48-72 часа).
В каких случаях используют бактериологический метод
Исследование проводят для диагностики инфекционных заболеваний с хроническим (реже – острым) течением. Локализация и степень поражения может быть различной. Общие примеры:
- ЗППП и инфекции мочевыделительной системы – хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз и др.;
- кишечные инфекции – дизентерия, брюшной тиф, сальмонеллез;
- хронические поражения органов дыхательной системы – синуситы, тонзиллиты, бронхиты, пневмонии;
- гнойные процессы различной локализации, в том числе гнойничковые поражения кожи. В данном случае определение чувствительности микроорганизма к антибиотикам особенно актуально;
- дисбактериоз слизистых структур – кишечника, половых органов, ротовой полости. Методика позволяет не только выявить патогенных и условно-патогенных возбудителей, но и сделать заключение о составе здоровой микрофлоры;
- сепсис – общее заражение крови.
Последовательность действий и особенности методики
Для проведения бактериологического исследования необходимо выполнить сбор материала и культивировать его на питательных средах с последующей микроскопией полученных штаммов и проверкой чувствительности к антибиотикам.
Сбор материала
Биоматериалом для исследования могут служить кровь, моча, ликвор, мокрота, сперма, кал, мазки из глотки, влагалища, уретры, любые другие ткани и жидкости из области инфекционного процесса. Образцы собирают в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и в течение 2-х часов доставляют в лабораторию. При необходимости пробы хранят при пониженных температурах.
Культивирование
Культивирование проводят с применением механических или биологических методов. Механический подход с использованием стандартных искусственных сред – наиболее распространенный. В данном случае для высевания образцов используют жидкие и твердые питательные составы. Наиболее распространенные – агар, мясо-пептонный бульон.
Посев материала производят с помощью специальной петли или пастеровской пипетки, растирая полученный образец по поверхности или вводя его в толщу питательной среды. Выделение бактерий производят из чистых культур, которые получают повторным посевом ранее выращенных колоний на новую среду.
Биологические методы подразумевают использование специальных питательных сред, которые учитывают особенности микроорганизма, в частности, чувствительность к некоторым химическим веществам, в том числе антибиотикам. В некоторых случаях применяют метод заражения лабораторных животных или тканевых культур с отслеживанием патологических изменений. Такой подход актуален при крайне незначительном накоплении микроба в тканях человека – в этом случае его выделение посевом на питательных средах не дает результата.
Микроскопическое исследование
Основной метод бактериологической диагностики – бактериоскопия. Она подразумевает визуальную оценку параметров микроорганизма под микроскопом. Для этого используют фиксированные и нефиксированные препараты.
Нефиксированные препараты позволяют исследовать живые образцы бактерий. Основные методы:
- раздавленная капля – образец придавливают между предметным и покровным стеклами;
- висячая капля – образец помещают в лунку на предметном стекле и герметично накрывают покровным.В качестве среды используют изотонический раствор или расплавленный агар. Методика позволяет наблюдать за живыми микроорганизмами в течение нескольких дней.
Фиксированные препараты используют для окрашивания с подробным изучением морфологических и некоторых биохимических параметров патогенов. Каплю бактериального состава размазывают по предметному стеклу и фиксируют пламенем горелки или специальными химическими составами.
Для определения свойств бактериальных препаратов используют ряд общих и специфических методик:
- микроскопия – определение формы, размеров, окрашивания по Граму;
- биохимические методы – исследование ферментативной способности микроорганизма к расщеплению тех или иных углеводов, аминокислот, метаболитов, в том числе способность к гемолизу, фибринолизу при попадании в кровь живых существ;
- серологические методы идентификации – реакции агглютинации под воздействием специфической сыворотки и другие антигенные свойства;
- биологические методы – заражение лабораторных ждивотных с проверкой патогенности и токсигенности взятых образцов, их устойчивости к антибиотикам.
Только совокупный анализ результатов всех методов диагностики – микроскопических, биохимических, серологических, биологических – дает объективный результат для вынесения точного диагноза.
Расшифровка результатов
Стандартный результат сводится к двум пунктам анализа:
- качественный анализ с определением факта наличия/отсутствия определенного возбудителя;
- количественный анализ с указанием числа микроорганизмов на единицу объема – выражают в КОЕ (колониеобразующие единицы). Чем выше этот показатель, тем сильнее бактериальное поражение организма данным возбудителем.
Внимание! Отрицательный результат является относительным и показывает отсутствие патогенных организмов лишь в отдельно взятой порции материала. Для большей объективности данных требуется повторное обследование.
Дополнительно указывают чувствительность микроорганизмов к основным классам антибактериальных средств – пенициллинам, тетрациклинам, цефалоспоринам, макролидам. Чем выше показатель чувствительности, тем успешнее будет лечение данным антибиотиком.
Источник
Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.
Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.
Бактериологический метод исследования включает:
1. посев исследуемого материала в питательные среды
2. выделение чистой культуры
3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).
Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:
I этап (работа с нативным материалом)
Цель: получение изолированных колоний
1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре
2. Подготовка материала к исследованию (разведение с изотоническим раствором NaCl и т.п.)
3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов
II этап
Цель: получение чистой культуры
1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).
2. Микроскопическое изучение изолированных колоний
3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).
4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.
III этап
Цель: идентификация выделенной чистой культуры
1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:
· морфология и тинкториальные свойства
· культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
· биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов, гликолитическая, протеолитическая и др. активность)
· серологические свойства (антигенные)
· вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
· патогенность для животных
· фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
· чувствительность к антибиотикам
· другие индивидуальные свойства
IV этап (Заключение)
По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре
Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.
При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводиться в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.
Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.
Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 12). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Таблица 12. Схема изучения колоний
№ | Признак | Возможные характеристики колоний |
1. | Форма | Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая |
2. | Величина, мм | Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) |
3. | Характер поверхности | Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая |
4. | Цвет | Бесцветные, окрашенные в … цвет |
5. | Прозрачность | Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные |
6. | Характер краев | Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые |
7. | Внутренняя структура | Гомогенная, зернистая, неоднородная |
8. | Консистенция | Вязкая, слизистая, крошковидная |
9. | Эмульгирование в капле воды | Хорошо, плохо |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа или под лупой.
Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).
Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).
При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.
Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина вмолекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).
Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных иконечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.
Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.
Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой — дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.
При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°С на сутки.
Заключение
Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.
Источник