Полимеразная цепная реакция на корь
Для постановки диагноза корь зачастую необходимо лабораторное
подтверждение инфекции. Самое лучшее время для сдачи анализов — первый контакт
пациента с врачом. Врача необходимо вызывать на дом, так как корь — это заразное
заболевание и поход в поликлинику может стать причиной заражения многих восприимчивых
детей и взрослых. Забор материала для исследования может выполнить врач или
медсестра, которую доктор может прислать чуть позже.
1 больной корью может заразить 12—18 восприимчивых человек [1]. Подробнее в статье «Как можно заразиться корью?».
Стандартом лабораторной диагностики кори в большинстве стран
являются серологическое исследование и ПЦР-диагностика.
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Суть метода заключается в идентификации РНК вируса кори в крови,
слизи носоглотки/ротоглотки, бронхиальном секрете или моче.
ПЦР-исследование рекомендуется проводить как можно раньше после
появления сыпи, так как количество вируса в организме снижается с течением
времени. Наиболее информативным является период первых 1—3—7 дней от начала
высыпаний [2—5]. В литературе имеются сведения о том, что у некоторых пациентов
вирус кори может определяться в носоглоточном секрете до 10—14 дня болезни [5].
Для наиболее точной диагностики рекомендуется производить забор
материала из трех разных локусов (кровь, мазок из носоглотки или ротоглотки и
моча). Это повышает вероятность правильного диагноза [4,5].
После забора материала для ПЦР (мазок и моча) допустимо его хранение
до 1 суток в холодильнике (4 °С), возможно замораживание. Если для исследования
используется моча, то ее объем должен быть не менее 10 мл, но лучше 50 мл. Утренняя
первая моча содержит максимальное количество вируса [4].
Отрицательный результат ПЦР не исключает диагноза кори [6].
Ложноотрицательный результат может быть получен при позднем заборе
материала (более 3—7 дней с момента появления сыпи), предшествующей недавней
вакцинации против кори, при нарушениях хранения и/или транспортировки образцов
[4,5].
В соответствии с международными рекомендациями при выполнении ПЦР
желательно определять генотип вируса кори. Это необходимо для четкого
различения происхождения вируса (дикий штамм или вакцинный), учета
распространения вируса по земному шару и происхождения очагов/вспышек
заболевания [4].
На сегодняшний день известно 24 генотипа вируса кори. Большинство
из них вышло из циркуляции, однако менее 10 из них (по данным ВОЗ — 6 [7]) все еще присутствуют на нашей планете [8].
2. Серологический метод.
Метод заключается в определении специфических антител (IgM и IgG) против вируса кори в сыворотке крови.
Для верификации диагноза кори достаточно определить один класс
антител IgM или IgG. Каковы особенности анализа?
— IgM.
IgM определяется в крови в течение 1 месяца (28 дней [3]) у больного
корью после появления высыпаний. Пик IgM отмечается
на 7—10 сутки от момента появления сыпи, а затем количество антител постепенно
снижается. Через 6—8 недель от начала сыпи IgM уже может не
определяться [9].
Если больной ранее прививался против кори (1 или 2 прививки) то
при реинфекции вирусом кори IgM у него может не определяться
вовсе или быть повышенным только короткий промежуток времени, который трудно
зафиксировать [6].
Отрицательный анализ на IgM не исключает наличие заболевания у ранее привитых.
В некоторых случаях у ранее не привитых пациентов IgM может быть ложноотрицательными
(около 20—25% проб). Это характерно для образцов, взятых в первые 72 часа от
начала появления сыпи. Дело в том, что концентрация антител в первые дни
болезни еще мала и недостаточна для определения [10,11].
Если результат был отрицательным и сыпь присутствует более 72
часов должен быть выполнен повторный анализ (допустимо выполнить анализ до 10
дня болезни) [6].
Кроме того, ложноотрицательный результат может быть получен, если анализ выполнен позже 28 дней с момента появления сыпи.
Ложноположительный результат возможен при проведенной ранней
вакцинации против кори (в течение предшествующих 6 недель до появления сыпи), наличии
повышенного ревматоидного фактора, при сопутствующих острых воспалительных
заболеваний [5].
В каждом отдельном случае проводится изучение течения заболевания,
особенностей пациента и/или дополнительная диагностика.
Наряду с определением IgM / IgG для диагностики кори, также настоятельно рекомендуется выполнять ПЦР [12].
Положительный анализ на IgM только при
наличии характерной клинической картины и данных о контакте с больным
корью свидетельствует об остром течении коревой инфекции. Положительный
анализ на IgM при отсутствии характерной клинической картины или контакта с
больным корью не является основанием для постановки диагноза. В таких случаях
рекомендуется выполнить ПЦР исследование [3].
— IgG.
Определение IgG является информативным анализом
для подтверждения кори в случае отсутствия возможности провести ПЦР
исследование и/или когда IgM является отрицательным или
сомнительным [6].
Исследование проводится в парных сыворотках: первый анализ должен
быть выполнен в первые 4—7 дней от начала высыпаний, второй — в течение 10—30
дней после первого [2,3].
IgG достигают пика через 4 недели от начала сыпи [9].
Положительным результат считается, если:
— произошла сероконверсия (в первом анализе IgG
отрицательны, во втором — положительны);
— отмечается значительное (в 4 и более раз) повышение уровня IgG.
Сероконверсия не является информативной при недавно проведенной
вакцинации (в течение предшествующих 6 недель).
Ранее вакцинированные, получившие две прививки и не выработавшие
защитных антител (такое встречается, но очень редко), при заболевании корью
могут не иметь повышение IgG в 4 раза при втором анализе IgG по сравнению
с первым [3]. Отрицательное значение IgG в двух
анализах исключает наличие коревой инфекции.
ИФА — метод, одобренный ВОЗ для определения IgG и IgM для диагностики коревой инфекции [10].
3. Вирусологический метод.
Для идентификации вируса кори иногда может применяться вирусологический метод. Суть его заключается в том, что вирус, полученный от больного, культивируется в клеточной культуре. Этот метод является особо точным, но занимает около двух недель. Вирусологический метод не рекомендуется для рутинного обследования при подозрении на корь [2,5,6,8].
Источник
Корь – высококонтагиозное антропонозное острое инфекционное заболевание с воздушно-капельным путем передачи. Возбудитель кори – РНК содержащий вирус (семейство Paramyxoviridae, род Morbillivirus). Только 1% восприимчивых лиц не заболевает корью при первом тесном контакте с больным.
Корь начинается с продромального периода, для которого характерны повышение температуры тела до 38°С и выше, кашель, насморк, чихание, покраснение глаз и светобоязнь, энантема в полости рта (пятна Филатова-Коплика). С 4-5 дня болезни наблюдается поэтапное высыпание пятнисто-папулезной сыпи (на первый день сыпь появляется на лице и шее, на второй день – на туловище, на третий день – на ногах и руках), на месте сыпи остается пигментация и отрубевидное шелушение. Инкубационный период длится в среднем около 10 дней (от 7 до 18 дней) с момента инфицирования дыхательных путей и до повышения температуры.
Несмотря на наличие доступных высокоиммуногенных вакцин, корь все еще остается одной из основных причин детской смертности в развивающихся странах и периодически приводит к возникновению крупных вспышек в индустриально развитых странах. В 2010-2011 годах крупные вспышки кори были зарегистрированы в ряде стран Африки, Юго-Восточной Азии и Европы (Франция, Германия, Болгария, Румыния). Особенно тревожная ситуация сложилась в 2012 году на Украине, где за три месяца заболело более 10000 человек. В Российской Федерации, большинство административных территорий которой в январе 2011 года были сертифицированы на отсутствие эндемичной кори, ситуация осложнилась в 2011-2012 годах в Южном и Северокавказском Федеральных округах, в Москве, Санкт-Петербурге и ряде других городов.
Вирус кори присутствует в крови, носоглоточных выделениях и моче во время продромального периода и в течение 3-4 дней с момента появления сыпи. АТ к вирусу кори впервые можно обнаружить в крови с момента появления сыпи. Максимальный уровень содержания АТ IgM в крови приходится на 4-7 дни после появления сыпи, они сохраняются в течение 28 дней, в редких случаях их можно обнаружить спустя 8 недель с момента появлении сыпи. АТ IgG начинают вырабатываться с момента появления сыпи и достигают максимального уровня через 2 недели; их можно выявить в течение долгих лет после перенесенной инфекции.
Показания к обследованию. Больные с диагнозом «корь», «корь ?» и с другими клиническими диагнозами, имеющие пятнисто-папулезную сыпь и температуру тела 37,5°С и выше.
Дифференциальная диагностика. Заболевания, протекающие с мелкопятнистой экзантемой (краснуха, скарлатина, инфекционный мононуклеоз, лекарственные и аллергические экзантемы, протекающие с повышением температуры тела).
Этиологическая лабораторная диагностика включает выделение вируса кори, выявление РНК вируса кори, обнаружение АТ к вирусу кори.
Материал для исследования
- Сыворотка крови – выявление АТ;
- моча, назофарингиальные смывы, лимфоциты периферической крови – выделение вируса кори;
- мазки из носоглотки и ротоглотки – выявление РНК вируса.
Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Лабораторная диагностика коревой инфекции в рамках Программы элиминации кори в РФ проводится только в вирусологических лабораториях Региональных центров по эпидемиологическому надзору за корью с помощью тест-систем, рекомендованных ВОЗ. Для лабораторной диагностики кори применяют главным образом выявление АТ к вирусу (серологическая диагностика). Для диагностики кори используют как обнаружение АТ отдельных классов (IgM и IgG), так и количественное определение специфических АТ в крови для установления их значимого прироста при одновременном исследовании двух проб, полученных от больного в остром периоде и в период реконвалесценции (парные сыворотки).
Для выявления вирусоспецифических АТ IgM и IgG в настоящее время используется преимущественно метод ИФА. Благодаря высокой чувствительности и специфичности, простоте и скорости выполнения, возможности автоматизации исследования, метод доступен любой лаборатории. Для получения корректных результатов и облегчения их интерпретации большое значение имеет правильно выбранное по отношению к появлению клинических симптомов кори время забора образца.
Для выявления изменения уровня суммарных АТ с использованием реакции нейтрализации (РН) цитопатического действия вируса кори, требуется наличие двух образцов сыворотки крови, взятых у больного в остром периоде заболевания и на стадии реконвалесценции. Метод обладает 100% чувствительностью по отношению к клинически подтвержденным случаям. Этот тест не является легким в применении, потому что он требует наличия высококвалифицированного персонала, имеющего опыт работы с культурами клеток. Результаты анализа могут быть получены через 10 дней после получения сыворотки реконвалесцента.
Оценка изменения содержания специфических АТ с использованием метода РТГА также требует наличия двух образцов сыворотки крови, полученных у больного в остром периоде и на стадии реконвалесценции. У вакцинированных лиц метод демонстрирует 98% чувствительность. Этот тест также не является легким в применении, потому что требует высококвалифицированного персонала, а также наличие свежих эритроцитов обезьян. Результаты анализа могут быть получены через 2 дня после получения сыворотки реконвалесцента.
Выделение вируса кори выполняют на культуре клеток Vero. Обнаружение и идентификация вируса кори на культуре клеток может занять несколько недель, поэтому не рекомендуется использовать этот метод для первичной диагностики инфекции, изоляция вируса кори проводится в специализированных лабораториях.
Выявление РНК вируса методом ПЦР с обратной транскрипцией не получило пока широкого распространения. Секвенирование генома вируса кори применяется в целях определения генотипа возбудителя кори. Генетический анализ позволяет сравнивать штаммы, полученные из различных мест в разные годы, что позволяет получить информацию о происхождении вирусов и проследить пути их передачи.
Показания к применению различных лабораторных исследований. Для диагностики кори ВОЗ рекомендует использовать обнаружение вирус-специфических IgM методом ИФА в образце сыворотки крови, взятом после четвертого дня от момента появления сыпи. Взятие крови для исследований осуществляется на 4-7 день с момента появления сыпи.
При выявлении АТ IgМ к вирусу кори у пациентов с лихорадкой и пятнистопапулезной сыпью, обследуемых в рамках активного эпидемиологического надзора за корью, дополнительно проводится исследование для выявления АТ IgG методом ИФА в «парных сыворотках». Взятие крови для исследований осуществляется на 4-7 день с момента появления сыпи (1-я сыворотка) и не ранее чем через 10-14 дней от даты взятия первой пробы (2-я сыворотка).
Для определения напряженности иммунитета к вирусу кори ВОЗ рекомендует применять выявление АТ IgG в сыворотке крови методом ИФА.
Для выявления вируса кори и его РНК используют биоматериалы, взятые в продромальный период заболевания и в первые три дня после появления сыпи. При взятии образцов следует учитывать, что интенсивность экскреции вируса быстро падает.
Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Вирусоспецифические АТ IgM появляются в течение первых дней с момента высыпания, спустя месяц их уровень начинает быстро снижаться. Их наличие в крови пациента достоверно свидетельствует об острой свежей инфекции. АТ IgM также вырабатываются при первичной вакцинации и, хотя их уровень снижается быстрее, чем уровень АТ IgM, вырабатывающихся в ответ на инфицирование диким вирусом, специфические АТ IgM к дикому или вакцинному вирусу не могут быть разделены используемыми в рутинной диагностике методами. В этом случае для интерпретации полученных результатов следует обратиться к истории вакцинации конкретного пациента.
Поскольку исследование АТ IgM методом ИФА обладает максимальной чувствительностью между 4-м и 28-м днями от момента появления сыпи, то исследование образца крови, полученного в эти сроки, считается адекватным для диагностики кори. Повторное взятие образца крови может понадобиться в случае отрицательного результата выявления АТ IgM в первом образце крови, полученном в течение первых трех дней от момента появления сыпи. Повторное взятие крови для выявления АТ IgG выполняют через 10-14 дней после взятия первого. Нарастание титра специфических АТ IgG в 4 и более раза при одновременном исследовании обеих проб с использованием стандартных тестов является основанием для постановки диагноза «корь».
Источник
Новый коронавирус поставил перед эпидемиологами множество вопросов, ответов на которые пока нет. Но они будут, уверен заведующий кафедрой эпидемиологии Иркутского государственного медицинского университета, доктор медицинских наук, профессор Александр Ботвинкин (на фото).
Для этого вуз начал тестировать население региона на наличие иммунитета к COVID-19, сообщил ученый «Российской газете».
Вирус пришел зимой
Александр Дмитриевич, я правильно понимаю, вы проводите не массовое тестирование, а научное исследование?
Александр Ботвинкин: Да. Накопив достаточно материала и проанализировав его, мы могли бы дать более объективную картину распространения инфекции и скорректировать стратегию борьбы с распространением COVID-19.
Поэтому мы не ставим задачу массово тестировать население области. Нам надо набрать достаточный для научного анализа материал, используя мощности Профессорской клинки университета и результаты, полученные в других клиниках и лабораториях Иркутска.
Но вы же не вслепую ведете исследование? У вас, наверняка, уже есть конкретные предположения, которые вы намерены проверить?
Александр Ботвинкин: Если проанализировать официальную информацию о количестве инфицированных и распространении COVID-19 в регионе, то можно заметить, что большая часть заболевших выявляется не среди местного населения.
Это гости из ближнего зарубежья или других регионов России. Яркий пример — трудовые мигранты, прибывающие на стройки Приангарья. Почему тогда не было резкого увеличения числа инфицированных коронавирусом среди местного населения, хотя обследованы десятки тысяч людей? Что это — результат превентивных мер по самоизоляции в начале эпидемии? Или других мер, снижающих вероятность передачи инфекции? А может, какой-то процент сибиряков уже перенес это заболевание и имеет иммунитет?
Известно, что в течение зимы у многих иркутян с симптомами острой респираторной инфекции обнаруживали коронавирусы человека, что могло изменить восприимчивость населения к COVID-19.
То есть, вы допускаете, что коронавирус мог циркулировать на территории Прибайкалья и раньше, еще до объявления пандемии?
Александр Ботвинкин: А почему бы и нет? Мы не можем игнорировать такую возможность. В качестве аргумента могу привести исторический факт. После того, как в 1970-е годы был открыт вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), оказалось, что с помощью новых лабораторных тестов его удалось обнаружить в пробах крови, собранных от людей гораздо раньше. Возможно, это не совсем корректный пример, так как ВИЧ-инфекция протекает хронически и передается другими путями. Но он демонстрирует, что наука должна проверять разные версии, а не только очевидные.
В поисках антител
Тест стопроцентно обнаруживает наличие антител к COVID-19?
Александр Ботвинкин: К сожалению, любой тест может давать как ложно положительные, так и ложно отрицательные результаты. Не исключены перекрестные реакции с родственными вирусами, например с коронавирусами человека. Но в целом иммуноферментный анализ (ИФА) считается достаточно специфичным и чувствительным тестом. Количественные оценки для тест-систем на антитела к новому коронавирусу пока отсутствуют, так как их широкое применение только начинается. Однако известно, что антитела вырабатываются в организме в ответ как на клинически выраженное заболевание, так и после бессимптомного течения инфекции.
С какого момента болезни можно обнаружить эти антитела?
Александр Ботвинкин: Антитела класса М можно обнаружить к концу первой недели после заражения. Это «первая линия обороны», и они довольно быстро исчезают. В дальнейшем начинают вырабатываться иммуноглобулины класса G. Они обнаруживаются в крови с конца второй недели после заболевания.
Количество антител достигает пика на второй-третий месяц после заражения, и в этот период они представлены в основном иммуноглобулинами класса G, которые сохраняются в организме до года и более. Именно присутствие в крови иммуноглобулинов класса G свидетельствует о перенесенной в прошлом инфекции.
Поэтому в лабораториях чаще используются тест-системы именно для выявления иммуноглобулинов G. Для COVID-19 такая тест-система разработана Новосибирским научным центром вирусологии и биотехнологии «Вектор». И еще несколько аналогичных тест-систем лицензировано.
Как проходит забор материала и, собственно, сам анализ на антитела?
Александр Ботвинкин: У обследуемого берется кровь из вены. С помощью центрифугирования или другим методом отделяется сыворотка, которая и служит материалом для исследования. После того как собрано достаточное для анализа количество проб, они доставляются в сертифицированную лабораторию. Для исследования используются специальные приборы — ИФА-анализаторы. Сам анализ занимает несколько часов.
А почему люди получают ответ через несколько дней?
Александр Ботвинкин: Пока ответ пациенту о наличии или отсутствии в его организме антител к вирусу COVID-19 действительно будут выдавать через четыре-пять дней. Требуется время для отработки всей технологической цепочки. В дальнейшем сроки получения результата, надеюсь, будут сокращены.
Сам себе лаборант
Говорят, в аптеках вот-вот появятся тест-полоски на антитела COVID-19. Просто каплю крови из пальца можно нанести и в лабораторию ходить не надо.
Александр Ботвинкин: Да, это так называемые хроматографические тесты, работающие по принципу тестов на беременность. Но их чувствительность ниже стандартного ИФА-анализа. Не исключено, что они могут появиться в аптеках.
Но я не думаю, что это хорошо, когда мы имеем дело с инфекционной болезнью. Надо принимать во внимание проблемы биологической безопасности и необходимость медицинских знаний для правильной интерпретации результата. Например, антитела могут быть обнаружены на 10-14 день после заражения, когда человек еще заразен.
Означает ли распространение ИФА-тестов, их относительно низкая стоимость и быстрое получение результата, что в дальнейшем они будут применяться для диагностики заболевания?
Александр Ботвинкин: Думаю, пока нет. Для диагностики заболевания тест на антитела не очень пригоден потому, что антитела могут быть определены спустя одну-две недели после начала болезни. С помощью теста ПЦР (полимеразная цепная реакция) на выявление COVID-19 имеется возможность обнаружить вирус раньше. И этот тест более специфичен и чувствителен. Хотя в Китае после эпидемии 2002-2003 годов были опубликованы статьи о целесообразности параллельного использования ПЦР и теста на антитела. В перспективе для массового обследования населения может быть разработан ИФА-тест для определения не только антител, но и вируса. Но на данном этапе основной смысл применения иммуноферментного анализа заключается в ретроспективной оценке закономерностей распространения коронавируса среди населения.
В ожидании вакцины
Существуют и применяются математические методы, с помощью которых можно прогнозировать пики, плато и спады эпидемии. Этого недостаточно? Нужны еще и тесты на антитела?
Александр Ботвинкин: Математические модели, на основе которых составлялись прогнозы, в основном, предполагали, что коронавирус распространяется в полностью восприимчивой к нему популяции. И каждый человек имеет равную вероятность заражения и заболевания. Но в реальной ситуации так бывает не всегда. Хорошо известно, что даже во время эпидемий чумы заболевали далеко не все жители города или страны.
Да, по сообщениям из ряда европейских стран мы видим, что рассчитанные кривые роста и снижения количества больных подтвердились. Но есть и другие примеры. Например, в нашем регионе аналогичные расчеты, к счастью, не оправдались. После выявления первых случаев число заболевших в течение апреля увеличивалось значительно медленнее в сравнении с прогнозом. Рост заболеваемости в мае в значительной мере обусловлен миграцией населения из других регионов, что в прогнозе не учитывалось. Очень важно понять, почему так произошло.
Сегодня много говорят о необходимости массового тестирования, в том числе и на антитела к COVID-19. Что вы думаете?
Александр Ботвинкин: Думаю, что массового тестирования не нужно. Для научных выводов достаточно выборочного обследования населения.
Практически важно обследовать медицинских работников — в случае положительно результата им не надо будет еженедельно проходить ПЦР-тестирование и будет гораздо спокойнее работать с больными. По-видимому, обследование контактных могло бы уменьшить нагрузку на обсервационные отделения.
С другой стороны, есть люди, заинтересованы в проведении такого исследования. Кто-то хочет общаться с пожилыми родственниками, зная, что уже переболел и не заразит их. Кому-то очень некомфортно ходить в масках и респираторах, а некоторые просто устали бояться.
А риск повторного заражения существует?
Александр Ботвинкин: Такой риск, согласно накопленным эпидемиологами данным, полностью не исключается. Глобальное распространение COVID-19 началось недавно, информации для окончательных выводов недостаточно. Однако, несомненно, что вероятность повторного заболевания для человека, в крови которого обнаружены антитела к коронавирусу, очень мала, по крайней мере, в течение первого года. В дальнейшем иммунитет может ослабевать.
Это справедливо и по отношению к иммунитету, который формируется после вакцинации. Например, вакцинированные в детстве от кори, могут заболеть во взрослом состоянии после контакта с больным. Поэтому предусмотрена ревакцинация и выборочное тестирование населения на антитела к вирусу кори. Аналогичные проблемы будут возникать после того, как начнется вакцинация населения против коронавирусной инфекции. Тем не менее, надо понимать, что вакцинация является единственным надежным методом профилактики респираторных инфекций. Но пока вакцины в нашем распоряжении нет.
А распространение COVID-19 продолжается, и приходится терпеть ограничения в общественной жизни. И, конечно, никто не отменял санитарно-гигиенические правила, которые уже прочно вошли в нашу жизнь: избегайте замкнутых пространств с большим скоплением людей, соблюдайте социальную дистанцию, не трогайте лицо руками, чаще мойте руки. И будьте здоровы.
Справка «РГ»
Тесты, выявляющие коронавирус, позволяют определить наличие его нуклеиновой кислоты у человека. Биоматериал для проведения анализа — мазки из рта и носоглотки. Этот тест также проводят перед выпиской пациента из госпиталя, чтобы проверить, освободился он от вируса или нет. Его повторяют два-три раза. Тесты на антитела определяют не сам вирус, а присутствие иммуноглобулина, который вырабатывается организмом для борьбы с возбудителем инфекции. Биоматериал для него — кровь. Вернее, ее сыворотка.
Все материалы сюжета «COVID-19. Мы справимся!» читайте здесь.
Источник
